生物学となんとか 〜理系大学生の日常

理系大学生が生物学について綴る日記。レポートを書く人と自分のために。。。

生産構造図の書き方

 

3連投です!!!

 

以前、「植物呼吸量」というレポートの中で、生産構造図を作成しましたが、この図は本来、手書きで良いものでした。しかし、手書きの図がジャーナルに載っていることは通常ないので、なんとかしてパソコン上でかけないかと色々調べた結果、Rというソフトを用いて描く方法を発見しました。しかしながら、そのサイトで紹介されていた実験手法と、自分たちが行なった実験手法が異なっていたことや、そのサイトがしばらく更新されていなかったことなどが災いして、かなり苦労しました。そこで今回は、自分が作成した生産構造図を作る方法を紹介したいと思います!

なお、この方法は以下のサイトに大きく基づいています。

sonamthashi.blog.fc2.com

 

まず、前準備としてRが作業するディレクトリを指定する必要があります。これをしないと、何か指示をしても、どの場所にあるファイルを使っていいかわからず、迷子になってしまいます。

次の画像のようにリムーバブルディスクEの中にあるRというファイルを指定したければ、" setwd("E:R") "と入力してエンターを押します。

 

次に、取れたデータから、data_DWとdata_lightを作成します。この時点ではエクセルで大丈夫です。data_DWではA列に光合成器官乾燥重量、B列に非光合成器官乾燥重量、data_lightではA列に高さの区切り(自分たちは7cm区切りでした)、B列に各高さの相対照度を入力します。

 

これができたら、このエクセルファイルをタブ区切り(.txt)のファイルに変えます。これは、エクセル上で簡単に行うことができ、「名前をつけて保存」のところで、名前をいじらずに、ファイルの種類をこの形にしてあげればOKです。

 

ここまでできたら前準備は終了です。次にRでこの文章を打ち込んでください。



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### initial setting ###
##################
par(oma =c(1,5,1,5)) #デバイス領域内で,作図領域の外に余白をとる.
par(mfrow=c(1,2)) #画面1行2列に分割する。
par(mar =c(5,0,5,0)) #複数の図間の余白を設定
par(mgp=c(1.0,0.1,0)) #軸からラベル、軸から目盛、軸から軸線までのマージンを設定
par(mgp = c(3, 1.2, 0)) #余白の使い方.説明,ラベル,軸の位置を行で指定.
par(family="Helvetica")

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###data preparation ###
####################
H <- 49#群落の一番高いところを指定する。

data_DW <- read.table("data_DW.txt", header=TRUE, row.names=NULL, sep="\t") #DWのCSVファイルを読み込む
data_light <- read.table("data_light.txt", header=TRUE, row.names=NULL, sep="\t")#相対照度のCSVファイルを読み込む

data_a <- data_DW[,1] #葉身の乾物データ
data_b <- data_DW[,2] #茎及び葉鞘の乾物データ
hight_light<-data_light[,1] #相対照度の高さ
light <- data_light[,2] #相対照度

result <- nls(hight_light ~ a + b*light^3 + c*log(light), start=list( a=0.1, b=0.1, c=0.1 )) #x^3 + log(x)による非線形の近似曲線
summary(result)
par <- result$m$getPars() #resultのmに格納されているa,b,cの係数を呼び出す

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###start plotting (left side) ###
##########################
barplot(data_a, xlab = expression(paste("photosynthetic organ[g DW]")),horiz=T, space=0, names.arg=hight,xlim=c(max(data_a)+0.5,0),axisnames=F, col="green") #axisnames=Fでy軸ラベルを削除

par(new=T); #グラフを重ね合わせます
plot(light, hight_light,ylim=c(0,H), xlim=c(1,100),xlab="",ylab="",axes=F, pch=1,ann=F) #相対照度のグラフを描きます

mtext("relative light intensity[%]",side=3,line=3) #2個目のx軸の名前を表示、sideは方向でaxisと同じ、lineは軸と""内の文字の間隔
mtext("hight [cm]",side=2,line=3) #y軸の名前を表示、sideは方向でaxisと同じ、lineは軸と""内の文字の間隔.lasは文字の向きを指定。

axis(3, las=1)#y軸目盛を縦書き
axis(2, las=2)#y軸目盛を縦書き

result #ちゃんと回帰式が乗っているか確認のため
par(new=T); #グラフを重ね合わせます

box() #各座標軸の付け根を閉じます

###########################
###start plotting (right side) ###
###########################
barplot(data_b, xlab = expression(paste("nonphotosynthetic organ[g DW]")), horiz=T, space=0, names.arg=hight, xlim=c(0,max(data_b)+0.5), axisnames=F) #非同化組織の棒グラフ導入

このプログラムの一つ一つで何を行なっているかを完全に説明することは、私にはできませんm(_ _)m

しかし、先ほどのサイトを元に、近似曲線を取り除き、非同化組織の区分わけを無くしたのが、だいたいこのプログラムだと考えています(もしかしたら過剰な部分があるかもしれませんが。。。)

このようにすると、次の生産構造図が出力されると思います。自分たちの実験結果で近似曲線を表そうとしたのですが、変な曲線になってしまったので、取り除きました。これは多分、実験を行った日が曇りで、太陽が出たり隠れたりして、照度がうまく取れなかったからだと思います。どうしても近似曲線を出したい方は、前述のリンクから頑張って見てください笑

 

f:id:k-ishikawa-science:20170801234140p:plain

 

Rは統計処理にも使えるソフトです。決してわかりやすいとは思いませんし、自分はまだできませんが、プログラムをカチャカチャっと書いて、統計処理なりなんなりをスパッとできたらめちゃくちゃかっこいいですね~(^^)

いつかは勉強してできるようになりたいです。無料なのも強みです!

 

 

ではでは〜

 

 

 

 

 

Real time RT-PCR レポート

細胞培養から連投です!

 

今回の実験では、Real time RT-PCRというのをやりました。

PCRといえば、おなじみ、DNAを増幅させる手法ですね。意外と理系でない方は知らないかもしれませんが、例えばDNA鑑定などをするときも「髪の毛一本で良い」というが、現実的にはその髪の毛一本ぶんのDNAから鑑定するわけではありません。そのように少量のDNAでは解析が困難であるため、PCRで増幅してから行います。

 

PCRでは94度で二本鎖を一本鎖にし、60度で合成の起点となるプライマーの結合、72度で合成を行います。このことと、熱に強いポリメラーゼを使うことは高校生物では頻出であるため、多くの方が知っていると思いますが、「実は合成の72度は、熱に強いポリメラーゼの最適温度であるだけであって、普通のポリメラーゼを使えば40度とかで良い。ではなぜ熱に強いポリメラーゼを使うのか?」と聞くと、大抵の高校生は答えられません。これは合成を行なった後、また一本鎖にする過程に戻って、というサイクルを重ねたいからです。一本鎖にするのは94度でないと行えませんから、したがって普通のポリメラーゼでは失活してしまい、ダメというわけです。

このことから、熱に強いポリメラーゼ(Taqポリメラーゼ)が見つかる前までは、1サイクル毎にポリメラーゼを加える必要がありました。

 

さて、今回のRT-PCRのRTは"reverse transcription(逆転写)"ですね。逆転写とは、RNAからDNAへ情報を移動することで、これは主な生物の通常の流れと逆になっています。このことによって、どの細胞も持っているDNAではなく、実際に発現されているmRNAの情報が解析できるわけです。

 

これらのPCRはあくまで定性的な解析で、定量的な解析は難しいとされてきました。これを解決した方法がリアルタイムPCRです。もちろん他にも方法はありますが。。。

リアルタイムPCRは、増幅の過程をリアルタイムで追うことで、定量的測定を可能にした方法です。PCRはサーマルサイクラー(温度を変えることのできる機械)だけでいいですが、リアルタイムPCRは増幅の過程をおう必要があるため、それに加えて、蛍光光度計を必要とします。具体的な方法はレポートを見てください!

 

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

・今回の参考文献

 

 

 

 

 

細胞培養 レポート

お久しぶりです

20日ぶりぐらいの更新です(^^;)

 

3つしかないテストが全て終わり、やっと夏休みになりました。この後、各授業について記しておこうかと思います。

 

さて、今回の実験では細胞培養を行いました。具体的には細胞のレドックス変化(酸化還元状態の変化)と細胞周期の話です。

 

こういった細胞培養の操作は、細胞の状態を保つため、全て無菌状態で行う必要があります。クリーンベンチ内で操作を行うことはもちろん、他にも様々な細かい注意点が存在します。

 

カフェインといえば、コーヒーやココア、コーラなどに含まれ、体にいいとか悪いとか色々な情報が錯綜していますが、今回の実験では細胞内の活性酸素種(ROS)濃度との関係だけを見た所、カフェインによって活性酸素種濃度が上昇したことがわかりました。

活性酸素種は、反応性の高い酸素のことで、その反応性の高さから体には毒だと考えられており、老化などと深い関わりがあるようです。しかしながら、いらなくなった細胞の除去に使われていたりなど、無くなれば良いというわけでもありません。したがって、カフェインによる濃度上昇が一概に悪いとはいえないのですが。。。

 

さらなる実験で、カフェイン添加でROS濃度が上昇したところに、水素水を添加する実験も行いました。水素水は最近、抗酸化作用など、美肌に効果があるとか言われて、芸能人が愛用していたり、お店でもよく売られていたりなどします。この効果については、今回の実験では、ROS濃度を低下させるという効果が認められました。つまり、効果は一応あるということですね。とはいえ、継続的な実験を行なっていないので、どのくらい効果が続くのかについては疑問点でもあります。また、水素は本来水に溶けにくいものですから、水素水中の水素濃度についても疑問が残ります。

もっと洗練された実験をすれば、これらの問題が解決できるような気がしますが、それはまた、今後の機会に。。。

 

 

それでは、レポートご覧ください!

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

・今回の参考文献

 

 

今回のレポートは、実習書に大きく変更点があった上、手順をレポートに書いているので、実習書はなしです!

 

 

 

抗体精製・ELISA レポート

今回の実験では、抗体精製とELISA法という実験を二週にわたって行いました。

 

抗体精製は、具体的にはEPOを免疫させたウサギの血清(特定の抗原を免疫させると血清中の、それに対する抗体が全抗体の5-30%になるそうです)からイムノグロブリンを精製するというものです。この際、アフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる、抗原抗体反応の特異性を利用した精製法を行いました。1週目ではこのように精製したイムノグロブリンが抗EPO抗体を持っているか確認するため、ドットブロット法というのを行いました。この方法は、膜に抗原(EPO)を結合させ、次に精製したイムノグロブリン、その次に酵素標識した抗EPO抗体に対する抗体、その後、その酵素と反応して発色を示す基質と順に添加することで、抗EPO抗体が存在するところだけが発色するという方法です。これを肉眼で見ると、精製したイムノグロブリン画分にのみ抗EPO抗体が含まれていることがわかりました。

 

2週目は、こうして精製したイムノグロブリンELISA法に用いるのですが、今回の目標はELISA法で未知試料のEPO濃度を求めることです。ELISA法も原理はドットブロット法に似て、初めに精製した抗体、次に未知試料と標準試料(EPO)、その次にまた精製した抗体、さらに酵素標識した抗EPO抗体に対する抗体、発色を示す基質といった順で添加し、今度は発色を吸光度測定することで定量を行います。

添加の手順は実習書の図がわかりやすいですね。

 

このような定量法は実際に臨床でも用いられており、pg(ピコグラム、10^-12 g)/mlオーダーでの検出ができるそうです。しかし、臨床で用いられているということは、その精度にも正確性がなければならないのですが、今回の実験では残念ながら臨床で用いるには不十分な精度となってしまいました。

なかなか難しいですが、改善点はたくさんあると思うので、まだまだ精度はあげられると思います!

 

ところでpgってすごいですよね(笑)

50kgの人が1pgオーダーの計測ができるというのは、ギザのピラミッドが1gオーダーの精秤をするようなもんです(^^; (比較がおかしいですかねw)

人間の力、おそるべし!

 

 

ELISA法ではこのように正確な定量が可能ですが、ドットブロット法では肉眼での比較による定量程度になってしまいます。このような時役に立つのが画像解析です。

例えば、今あなたが読んでいる字はおそらく黒でしょうが、この「黒」というのは完全に主観的な判断ですよね?

世界的にも数%の人が色覚障害を持っていたりする中で、色を客観的に決定するというのは大事なことに思います。

ということで、今回はドットブロット法で色がついた点、つかなかった点の客観的判断をするために、Image Jによる画像解析を行いました!(班員にはオーバーキルだと言われましたが。。。(^^; )

 

 

ではでは、どんな実験か詳しく見てみてください!今回のレポートは、抗体精製とELISAに分かれています。

 

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

・今回の参考文献

 抗体精製

 ELISA

 

 

 

 

抗体精製↓

ELISA

分光学的測定の基礎 レポート

今回は、紫外可視光分光光度計と蛍光光度計を使った実験を行いました!

 

なんじゃそりゃ?という人のためにさらっと説明します。紫外可視光分光光度計は試料の吸収する光の波長を見てあげる装置です。例えば、赤い溶液があったら、それはおそらく緑色の波長の光や青色の波長の光を吸収しているはずですよね?そういった波長ごとの吸光度を計測して、例えば核酸蛋白質定量、色素の特定だったり(他にも用途はたくさんありますよ!!)ができるのです。

一方で蛍光光度計は、物質が光のエネルギーを受け取って励起状態(エネルギーを通常より持った状態)になり、その後基底状態(通常の状態)に戻る時に光を発する(この光を蛍光という)という特徴を利用して、その蛍光を計測してあげる装置です。励起させる光(照射する光)の波長を変えながらある一定の蛍光波長の蛍光強度を測定すると「励起スペクトル」、励起させる光の波長を一定にして蛍光強度を読み取る蛍光波長を変えながら計測すると「蛍光スペクトル」が得られます。通常、励起スペクトルは吸光スペクトルと同じ形を示します。これは吸光度が大きい=そのぶん受け取る光のエネルギーも大きい という関係が成り立つからです。

 

 

このような機械を実験で用いる際、ただ単にルーティンワークで計測を行っている程度なら問題ないのですが、実験結果を吟味しようと思うと機械や方法の原理についての理解がとても重要になってきます。今回の実験では、そのような原理の理解が必須となり、装置としては去年から利用していたものの理解が深まって、勉強になりました。

 

 

さて、今回のレポートは2万字を超えました(笑)。ちなみに前回の酸素電極のレポートが1万7000字程度、今週進めているレポートが恐らく同じくらいになりそうです。多分、1週間の実験レポートには20-30時間程度かかっています。本気で作っているからですが、さすがに毎週2万字級のレポートを生み出すのは辛いですね。。。(^^;

 

でも、それだけ力を入れてやっているので、レポートをみれば原理等もよくわかると思います!

 

 

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

・今回の参考文献

 

 

 

 
 

酸素電極による電子伝達活性の測定 レポート

今回の実験は「酸素電極による電子伝達活性の測定」でした。

 

酸素電極とは、酸素の濃度変化をかなりの精度で(1nmol/mLオーダー)計測することのできる機器です。光合成では通常、光化学系Ⅱというところから、水を分解されてできた酸素が発生します。この酸素発生は、電子の伝達によるものであるため、酸素発生を計測することで電子伝達活性がわかるというものです。通常の光合成は次のような機構で成り立っています。(図1)

 

f:id:k-ishikawa-science:20170620222542p:plain

図1 通常の光合成過程

 

これは、葉の中での電子伝達活性を計測しているわけですが、これはNADP+という電子受容体があるからこそ、電子伝達が行われるのです。一方チラコイド膜を単離した状態では電子受容体が存在せず、人工的電子受容体を添加する必要があります。こういった試薬を工夫することで、光化学系Ⅰだけだったり、光化学系Ⅱだけだったりの電子伝達活性を計測することができるようになります。(図2ー4)

 

f:id:k-ishikawa-science:20170620223433p:plain図2 光化学系Ⅱの電子伝達活性測定の過程

f:id:k-ishikawa-science:20170620223510p:plain

図3 光化学系Ⅰの電子伝達活性測定の過程

f:id:k-ishikawa-science:20170620223538p:plain

図4 チラコイド膜での全体の電子伝達活性測定の過程

 

 

 

さて、光合成の研究関係では、かなりネット情報が充実していたことに驚きました。

例えば酸素電極の話は光合成の森(http://www.photosynthesis.jp/proto/O2evolve.html)

やHUSCUP(http://eprints.lib.hokudai.ac.jp/dspace/bitstream/2115/39192/1/67-076.pdf)に詳しく載っています。他にも日本光合成学会の「光合成事典」(http://photosyn.jp/pwiki/index.php?%E5%85%89%E5%90%88%E6%88%90%E4%BA%8B%E5%85%B8)もとても役に立つ情報が載っていました。

 

社会的にも「理系」の世界はあまり馴染みがなく、やはり政治や経済の面が強調されてる一面があります。もちろん理系的なことが理解するのが難しいという側面や、政治経済の方が自分に直接関係あるという側面があるのは確かだと思いますが、大学生が学ぶ理系のようなことはなかなかネットでは情報が少ないのが現状だと思います。そんな中で「光合成」というワード関連の事柄だけでも詳細な情報が載っているのは嬉しいことですし、みなさんがアクセスできる環境があるというのは、研究に直接関わる人だけでなく一般の人の知的好奇心を刺激するのにいいことだと思います。

 

 

それではどんな実験をしてどんなレポートを書いたのかご覧ください!

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

・今回の参考文献

 

 

 

 

 

 

植物呼吸量 レポート

こんにちは!

先週は「植物の呼吸消費量の測定」という実験を行いました。

具体的にはトマトの鉢植えを層別刈り取りして、生産構造図を作ることと、葉・茎・根に分けて呼吸速度を測定し、有機物消費量まで計算で求めました。

 

結果としては葉<茎<根の順で呼吸速度が大きかったです。さて、植物の呼吸速度が具体的に何を意味しているのかは議論のしようがあるところだと思います。

自分は主に、光合成でのATP産生で足りない分のATPを産生することと、呼吸量が多ければ有機物消費量も多くなるはずなので、成長に関わっているのではないかと考えました。

しかしながら、これだけのネタで考察を書き進めるのはなかなか難しく、今回も植物生態学の研究室の実習でうまくレポートを書くことができませんでした。。。

 

やはり、複雑なメカニズムが関わっている現象をどう理解するのか、どう単純化するのかには非常に難しい部分がありますね。

 

 

今回の実験では、自分たちで用意したサンプルの呼吸速度を計測するということも行いました。自分たちの班では、若葉と古い葉の葉緑体量が異なることに目をつけ、若葉と古い葉、中間の葉が色で見分けられる「ベニカナメモチ」を用いて呼吸速度を計測することにしました。

ベニカナメモチは、若葉が真っ赤で、古い葉は緑、その間は赤と緑が混ざっているので、実験サンプルとしてはとっても適しています。

 

皆さんはこの3種の葉の呼吸速度を計測するとどうなると思いますか?

結構意外な結果が待っていたので、ぜひレポートを読んでみてください!

 

 

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

・参考文献表(今回は一つだけになってしまいました。。。)

 1. 日本植物生理学会ホームページ「カナメモチなどの若葉の赤色化について」(https://jspp.org/hiroba/q_and_a/detail.html?id=3516) 2017/06/04閲覧