生物学となんとか 〜理系大学生の日常

理系大学生が生物学について綴る日記。レポートを書く人と自分のために。。。

タンパク質の単離精製  レポート

二連投です!

今回の実験は1月に行ったものです!(年またいでないですよ笑)

 

今回は、GFPという蛍光タンパク質をベクターに組み込んで大腸菌内に入れ、大腸菌内で大量に作らせたGFPを単離精製するという実験です。

5月ごろに行った制限酵素実験では大腸菌に導入したDNAがちゃんとできているか確認しましたが、今回はタンパク質ができているかの確認です。

 

今回、精製に用いた方法がタンパクの疎水部分とカラムの結合をもってタンパクを吸着させる、疎水性相互作用クロマトグラフィーでしたが、この方法は通常、精製の一番初めの段階で用いられるもので、分離能がとても低く、次の図のように大腸菌由来と思われる多数のタンパク質も検出されてしまいました。

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単離ができなかったため、この後、タンパク質の分子量からどのバンドがGFPのものか推測するということを行いましたが、こうなることになったとしてもそうでなくても、この実験デザインでは、実際に出てきたバンドがGFPかどうかをはっきりさせることができません。

これをはっきりさせるためには、ポジティブコントロールが必要です。要するにSDS-PAGE(タンパク質の電気泳動)を行う際にGFPを同時に流してあげるということです。

あとは疎水相互作用クロマトグラフィーを変更して、抗GFPをカラムに結合させた、アフィニティークロマトグラフィーを用いれば、GFPのみを単離精製することができます。

いずれも今の方法よりかコストがかかると思いますが、GFPを単離精製・確認するにはこうした方法を用いるのがベストだと思われます。

 

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

・今回の参考文献表

 

 

 

 

 

 

 

in situ hybridization レポート

お久しぶりです笑

しばらく忙しい日々が続き、年末に行った実験のことを書いていなかったので、書きます(_ _)

 

今回の実験ではin situ hybridizationという方法を習得しました。hybridization(動詞はhybridize)というのは、基本的にRNAやDNAの配列の相補性を用いて二本の鎖をくっつけることを意味します。in situというのはその場で、要するにDNAだけ取ってきて何か行ったりするのではなく生体内で、組織で何かを見ることを意味します。

 

これだけ言ってもわかりにくいと思うので、今回の実験を例に説明します。

まず、あるマウスの全ての細胞は同じ遺伝情報(DNA)を持っていますが、そこからタンパク質を作るために媒介するmRNAは細胞によって量・質が異なります。(これが同じDNAから心臓の細胞、目の細胞、爪の細胞などと異なる細胞ができる原因です。)そこで、脳内のどの細胞がどういった遺伝子を発現しているのかを知るために、in situ hybridizationを行うわけです。

例えば、Reelinという遺伝子が大脳のどこに発現しているか知りたいとします。この場合、ReelinのmRNAに対応する配列を持つプローブを作製し、それを脳の切片に添加することで脳内のmRNAとプローブがハイブリダイズし、その後プローブを発色させることで、ReelinのmRNAを可視化するといった手順を行います。

 

 

今回の染色は蛍光染色ではありませんでしたが、蛍光染色をすると、大脳の層構造に従って、下の画像のように綺麗に染色されます。

 

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大脳皮質の6層構造。表層から第1層(Reelin, シアン)第2/3層(Brn2, 赤)、第4層(RORß, 緑)、第5/6層(Ctip2, 青)のニューロンから構成されている。

大脳皮質発生研究チーム 理化学研究所 多細胞システム形成研究センター(CDB)

より

 

in situ hybridizationは脳の構造にとどまらず、様々なところで用いることのできる基本的な手法です。生物に関わる研究を行う人なら、ほとんどの人が経験することになるのではないでしょうか。。。

 

 

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

 

・今回の参考文献

 

 

 ↓実習書

 ↓レポート(結果はp10~)

 

western blot レポート

久しぶりの更新となってしまいました。

新年あけましておめでとうございます!

今年は勝負の年ですので、今まで以上に精力を入れてやっていきたいと思います(^^)/

 

さて、この実験は昨年におこなったものですが。。。

今回の実験はwestern blottingです。

 

この類のblottingの歴史はSouthern blotting から始まりました。これは、様々な配列を含むDNAのサンプルを電気泳動した後、その中に特定の配列のDNAが存在するかを存在するかを調べる方法です。

 

それ以降、RNA、タンパク質でも同様の方法が開発され、それぞれnorthern, western blotting と命名されました。

 

特にwestern blottingでは実際に発現しているタンパク質を解析できることから、広く用いられています。あまりに基本的な手法であるので、基本的な実験手法の本や企業のサイトなどを見れば詳細が分かるので、ここでは詳しい説明はしないことにします(逃

しかし、レポートや自分が使った参考文献は役に立つと思うので、見てみてください!

 

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

 

・今回の参考文献

 

 

 

 

 

 

顕微鏡標本 レポート

こんにちは!

 

 

今回の実験ではウシガエルのオタマジャクシの脳下垂体の染色・観察を行いました。

 

脳下垂体は、前葉・中葉・後葉に分けられますが、それぞれを構成する細胞の性質が異なることが知られています。

先にそれぞれの性質を言ってしまうと、まず前葉は高校生物でもおなじみの成長ホルモンや甲状腺刺激ホルモンなどと言ったホルモンを分泌する細胞が存在している場所です。一方で後葉は神経分泌と呼ばれる分泌性細胞ではなく神経がホルモン分泌する場所です。中葉はあまり働きがわかっていないようですが、メラニン形成を刺激するホルモンを分泌する細胞は含まれるようです。

 

さて、染色液を工夫することで、これらの場所を染め分けることができます。例えば、AF(アルデヒドフクシン)だったら、神経分泌顆粒を青紫に、オレンジGだったら、酸好性細胞(前葉に含まれる成長ホルモン分泌細胞などはこの類です)をオレンジに染めることができます。

 

 

 

このような昔ながらの組織化学染色は、今となってはあまり有用ではない気もしますが、比較的単純なことを手早く知りたい時には有効な手段かもしれません。

 

最近読んだScienceによると、今ではsingle cell の発現解析も夢ではないそうで、技術の進歩はすごいものですね(^^) 

今回の実験のような単純解析でわからなかったことは、次の段階の解析を行えるという点で、脳下垂体に関しても現在ではより多くのことがわかっているのではないでしょうか!

 

 

↓ちなみに今回観察した断面です笑

 

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最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

当然スケッチを描いたのですが、スキャンしても色がほとんど見えなかったので、カットします!想像してくださいw

 

・今回の参考文献

 

 

 

 

トランスジェニックマウス胚の解析 レポート

こんにちは!

1ヶ月ぶりくらいの更新です。最近は実験を行う週が少ないこともあって、更新が滞りますね笑

 

 

さて、今回の実験ではトランスジェニックマウス胚の解析を行いました。マウスにおいて、Foxg1という遺伝子をトランスジェニックすることによって、本来Foxg1が発現している部分を染められるようにしようというものです。

 

Foxg1の異常に関する病気は人間でも知られており、以下のサイトで詳しく取り上げられています。

 

About FOXG1 Syndrome

 

Foxg1そのものの具体的な役割については、結構メカニズムが複雑なようで、完全に理解はされていませんが、大脳新皮質の適切な積層に重要な役割を持っていることがわかっているようです。

 

 

今回は初めてマウスを使っての実験を行いましたが、やはりマウスを実験のために殺すということは重いことで、色々考えてしまいました。

そこらへんにいる虫でも、今あなたが食べている野菜や肉でも、世界動物園水族館協会とのいざこざで問題になったイルカでも、実験で用いるマウスでも、同じ命です。

イルカを殺して騒ぐ人たちも、虫を殺して騒ぎはしません。完全な人間のエゴイズムです。自然界の動植物からしたら、わけがわからないですよね(^^;

 

私も確かにゴキブリよりかはイルカの方が可愛いと思いますが、そういった人間の自分勝手な思考というのが大嫌いなので、革新的な動植物(自然)と人間の共存の仕方をbiologicalなアプローチで提案できるような研究がしたいと思っています。かなり究極目標ではありますが。。。

 

 

 

実験そのものの話が少なくなってしまいましたが、詳しくはレポートをご覧ください!

 

 

 

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

・今回の参考文献

  • Duchefa Directホームページ “X-gal” (http://www.duchefadirect.com/X-Gal/) 2017/11/06閲覧
  • 佐々木博己 他著(2011/1)「目的別で選べるPCR実験プロトコール」株式会社羊土社 第1刷
  • Xuan et al., Neuron 14, 1141 (1995).
  • Hanashima, L. Shen, S. C. Li, E. Lai, J. Neurosci. 22, 6526 (2002).
  • Hanashima, S. C Li, L. Shen, E. Lai, G Fishell, Science. 303, 5654(2004).
  • Kumamoto, et al, Cell Reports. 3, 3(2013).
  • Pauley, S., Lai, E. and Fritzsch, B. (2006), Foxg1 is required for morphogenesis and histogenesis of the mammalian inner ear. Dev. Dyn., 235: 2470–2482.
  • Cynthia D. Duggan, Shannon DeMaria, Ariane Baudhuin, David Stafford, John Ngai, Journal of Neuroscience 14 May 2008, 28 (20) 5229-5239.
  • Casellas, Animal(2011), 5:1,pp1-7.
  • 日本クレア株式会社ホームページ「近交系」(http://www.clea-japan.com/animalpege/animal01_06.html) 2017/11/07閲覧

 

 

 

 

 

DNAのクローニング・MSRE-PCR法によるメチル化DNA解析 レポート

こんにちは!

 

いよいよ秋学期も始まり、最初の実験が終わりました。

今回の実験は2週にかけて二つのテーマを扱いました。

 

一つ目はDNAのクローニングです。ある特定のDNA領域を増やそう!というのが大きなテーマです。

このようなあらゆる分野の基本的なこととなるクローニング技術は非常に重要です

今回の実験では、pUC19というベクターを用いてλDNAの特定の領域を大腸菌内で増やすということを行いました。

 

フェノール抽出・エタノール沈殿電気泳動などといった非常に基本的なことをしっかりと学ぶことで、自分のモノにできたのではないかと思います(^^)

 

また、全て終わった後にプラスミドのシークエンスを解析するというのが追加され、解析自体は業者に頼んだのですが、自分のサンプルを初シークエンスしました笑

 

シークエンスと電気泳動から、λDNAの数ある断片のうち、どれが増やせたのかを同定しましたが、私はあまりうまくいきませんでした^^;

 

このように簡単で実習書どおりに行えば誰でもできるような作業でも、習熟しないと結果として満足いくものが得られないものなんだと痛感しました。

 

 

もう一つはDNAのメチル化の解析です。

モデル生物と呼ばれる様々な生物の全塩基配列が明らかになっていく中で、DNAの塩基配列によらない発現制御が今ホットな話題になっています(例えば、あなたの目も爪も同じDNAを持っているはずなのに、機能が全く違いますよね?)

 

このような発現制御の代表例がDNAのメチル化です。DNAがメチル化されていることにより、発現が起こらなくなるといった現象です。

今回は食虫植物の腺毛と葉のメチル化の違いを解析しましたが、がんの話でもほとんどがメチル化が関連しているようです。

 

 

さて、今回行った方法はメチル化を認識して、切断を起こさない制限酵素と認識しない制限酵素を用いて対照実験を行い、電気泳動の結果からメチル化してるかしてないかを解析するという方法をとりましたが、一般的には少し異なる方法で行われているようです。

それは、1本鎖のDNAのシトシンをウラシルに変える働きをもつ、重亜硫酸ナトリウムという物質を使う方法です。メチル化の多くはシトシンに起き、この重亜硫酸ナトリウムはメチル化したシトシンはウラシルに変えることができません。この物質によって処理をした後、PCR sequencingなどの解析をすれば、メチル化を解析することができます。

 

 

 

塩基配列によらない発現制御を対象とする学問をepigeneticsと言いますが(epigeneticな制御 など)、何が火付け役になるかはわかりませんが、この言葉が多くの人が知る言葉になる日も近いのではないでしょうか?(^^)

 

 

 

 

最後になりますが(恒例)、レポートなどの盗用犯罪です!同じようなレポートを書く方のために参考文献表をはりますのでそれらを参考にしてみてください!

 

・今回の参考文献

DNAのクローニング

 

MSRE-PCR法によるメチル化DNA解析

  • 中山広樹・西方敬人 著(1999年11月) 「バイオ実験イラストレイテッド ①分子生物学実験の基礎」 株式会社秀潤社 第1版第7刷
  • GEヘルスケアジャパン株式会社ホームページ「Nucleon PhytoPure」 (https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/0555.html) 2017/10/06閲覧
  • 東中川徹 他著(2015年8月)「ベーシックマスター 分子生物学」株式会社オーム社、改訂2版第3刷
  • 大山隆・東中川徹 著(2016年9月)「新・生命科学シリーズ エピジェネティクス」株式会社裳華堂 第1版第1刷
  • Nishimura E Kawahara M Kodaira R et al. . 2013. S-like ribonuclease gene expression in carnivorous plants. Planta 238: 955–967.
  • フナコシフロンティアインライフサイエンス ホームページ「フローチャートで解説!メチル化解析受託サービス,創薬支援サービス。エピジェネティクスカタログ <受託サービス>」(http://www.funakoshi.co.jp/contents/7316) 2017/10/09閲覧
  • Li Y, Tollefsbol TO. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). 2011;791:11-21. doi:10.1007/978-1-61779-316-5_2.

 

 

 

 

 

 

DNAのクローニング↓

 

 

 

MSRE-PCR法によるメチル化DNA解析↓

 

TOEFL結果と今後の対策

こんにちは

 

9/27(受験後10日後) 14:00ぴったりにテストの結果が閲覧可能になりました!

約10日後ということでしたので、それより前から毎日個人ページにログインして確認していたのですが、テスト結果が閲覧可能になるとメールがくるのですね笑 

 

 

さて、結果ですが

 

Reading:Listening:Speaking:Writing = 28:22:17:20 = 87

 

でした!

 

内訳こそ違うものの、前に予想した得点と合計点が完全に一致しています笑

とりあえず目標としていた80-100の間の点数を取れて一安心ですが、これから100点突破が非常に苦しい時間になりそうです・・・

 

結果が出てから約1週間、いろんなサイトをあさり、これからの対策をたてました。セクションごとに紹介します。

 

 

・Reading

 今回の結果ではやはり自分が受験勉強から積み重ねてきた結果が出たかなという感じでした。かといって、この点数を落とすわけには行かないので、とりあえず単語力の補強をメインに、余裕があれば実践演習をたまにはやりたいと思います。単語についてはこれからGREの勉強もしていこうと思いますので、ちょうどいいですね(^^)

 

・Listening

 自分で演習していた時から、約7割くらいの得点率だったので、それがそのまま出た感じです。これからは、まずは圧倒的に英語に慣れるためにpodcastの有効活用。そして、問題の一語一語を理解できるまで聞くというのを演習で少しずつ行いたいと思います。そうして分からなかった部分を重点的にやっていけば、自分の聞き取れる表現のストックが増えていくのではないかという考えです。

 

・Speaking

 これは予想よりも低い点数で、案外採点が厳しいのだと感じました。とりあえず全ての問題を3/4点に持っていきたいところです。。。

 これからはこのセクションに最も労力を割こうと思っているので、かなりやることを増やしました。

 1. 独り言

  私にはネイティブの友人などいないので、家でひたすら独り言を言おうかと思いますw 現在一人暮らしなので、家族などに気持ち悪がられる心配はありません笑

 2. 瞬間英作文

  割と色々なところで言われていますが、単純な文を瞬間的に出力する力を磨くために、瞬間英作文をやっていこうと思います。実際に効果的かはわかりませんが、とりあえずやりたいと思います。

 3. 表現のための実践ロイヤル英文法

  speakingでもwritingでも文法的にerrorが多かったらしいので、少し英文法に磨きをかけたいと思います。それとこの別冊の例文集が結構いいらしいので、writingにも使えるかなと思って、やっていこうと思います。

 4. TOEFL TEST対策iBTスピーキング2周目・実践演習

  ひたすら演習し、各問題で4点が取れるところまで繰り返し問題をやるというのを徹底していこうと思います。以前までは一回問題をやったら、少し確認して次、みたいな感じだったので。。。

 

・Writing

 これは点数が意外でした、悪い意味で。やはり特別な対策をしないといけないなというのを痛感させてくれたので、いい機会になったと思います。とりあえず参考書を1冊(Speakingと同じシリーズのもの)を完成させて、文の構成などを学び、そのあとは実践演習としたいと思います。independentの方はサイトに185題の解答が転がっていたので、とても参考になるかなと思います。是非とも満点を取りに行きたいセクションですね。

 

 

 

 

次回はまだ決定ではないのですが、2月あたりに受験しようかと思っています。受験料がアホみたいに高い(25000円以上)ので、次回の受験できっちり100点をいただきたいと思います!

目標点は

Reading:Listening:Speaking:Writing=28-30 : 26-30 : 23↑ : 27-30 = 104↑

くらいですかね。

有言実行となるように頑張って行きたいです(^^)ノ

 

See you next time!